LUYOR-3415RG在玉米轉(zhuǎn)化體篩選中的作用

玉米廣泛分布于全國各地，是我國重要的糧食、飼料和工業(yè)作物之一，種植面積和產(chǎn)量均居前列。玉米喜溫暖、光照充足的環(huán)境，適宜在土層深厚、排水良好的中性或微酸性壤土中生長(zhǎng)。作為耐旱能力較強(qiáng)的作物之一，具有較高的適應(yīng)性和栽培靈活性。

中國農(nóng)科院在《Journal of Integrative Plant Biology》期刊發(fā)表文獻(xiàn)《Development of cytosine and adenine base editors for maize precision breeding》，文獻(xiàn)中指出LUYOR-3415RG 熒光手電筒作為核心檢測(cè)工具，在基于種子熒光報(bào)告系統(tǒng)（SFR）的玉米轉(zhuǎn)化體篩選中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。研究構(gòu)建的 SFR 系統(tǒng)包含胚乳特異性紅色熒光蛋（DsRED）表達(dá) cassette（EnSFR）和胚胎特異性綠色熒光蛋白（eGFP）表達(dá) cassette（EmSFR），通過 LUYOR-3425RG 的特定激發(fā)波長(zhǎng)可快速區(qū)分不同轉(zhuǎn)化載體的種子。

為了實(shí)現(xiàn)快速篩選，我們將玉米的SFR系統(tǒng)（Dong等人，2018）整合到新型CBEs中。具體而言，我們開發(fā)玉米精種的穩(wěn)健基礎(chǔ)編輯器。研究人員在多種CBE載體中分別插入了靶向胚乳的紅色熒光蛋白表達(dá)盒（EnSFR）和靶向胚胎的綠色熒光蛋白表達(dá)盒（EmSFR）（圖2A、S2 )，從而篩選出不同的轉(zhuǎn)化載體（圖2 B）。玉米轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的傳遞法完成。最終共獲 得47個(gè)T0代轉(zhuǎn)基因事件。使用LUYOR-3415RG激發(fā)波長(zhǎng)為480和550納米，根據(jù)熒光特性對(duì)種子進(jìn)行分類。在胚乳特異性啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)DsRED的 種子，在550納米波長(zhǎng)下呈現(xiàn)紅色熒光。相比之下，那些受胚胎特異性調(diào)控的種子則表現(xiàn)不同。

啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的eGFP表達(dá)在480納米波長(zhǎng)下呈現(xiàn)綠色熒光（圖2 B）。我們鑒定出24株攜帶CBE-A的轉(zhuǎn)化體、14株攜帶CBE-C 的轉(zhuǎn)化體以及9株同時(shí)攜帶CBE-A和CBE-C的轉(zhuǎn)化體。此外，還鑒定出9株攜帶CBE-F的轉(zhuǎn)化體、8株攜帶CBE-R的轉(zhuǎn)化體和 4株同時(shí)攜帶CBE-F與CBE-R的轉(zhuǎn)化體（圖2C）。通過使用針 對(duì)不同胞嘧啶脫氨酶的特異性分子標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與熒光 檢測(cè)法的鑒定結(jié)果一致（圖S3）。這種SFR系統(tǒng)的整合顯著提升了生物效應(yīng)載體（BEs）篩選的穩(wěn)健性和效率，在研發(fā)及應(yīng)用中具有重要價(jià)值。

LUYOR-3415RG 通過特異性激發(fā)雙熒光標(biāo)記，成為連接載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化體篩選與后代驗(yàn)證的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，為高效開發(fā)玉米堿基編輯工具和抗除草劑突變體提供了重要支撐。同時(shí)該研究也證實(shí)，LUYOR-3415RG便攜式熒光蛋白激發(fā)光源能夠觀察GFP、eGFP、dsred、Mcherry、Tdtomato等綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的表達(dá)。

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